草铵膦（PPT）是一种广谱除草剂，其中，L-草铵膦（L-PPT；精草铵膦）具有优势除草活性。为了有效地生物合成L-PPT，所使用的生物催化剂必须具有高度的选择性、对底物的耐受性和热稳定性。转氨酶（TAs）是一类重要的参与L-PPT生物合成的酶，TA分为PLP折叠Ⅰ型和Ⅳ型，折叠Ⅰ催化合成L-对映体。但一些用于不对称合成L-PPT的TA存在低的平衡常数，导致不利的热力学平衡，通过多酶级联反应去除副产物可以有效地改变转氨反应中的反应平衡，但目前没有很好的用于工业生产L-PPT的生物催化剂。基因挖掘和蛋白质工程常用于获得新型生物催化剂，采集和鉴定从极端环境中分离出来的微生物，是发现能够经受工业生产条件生物催化剂的有效策略。

图1  L-PPT生物合成的多酶级联体系

       2024年1月30日，浙江工业大学生物工程学院院长、国家化学原料药合成工程技术研究中心副主任郑裕国团队，在《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志发表了题为“Identification of a novel thermostable transaminase and its application in Lphosphinothricin biosynthesis”的研究论文，在这项研究中，研究者通过序列挖掘和结构功能分析，从耐热假单胞菌中获得了一个活性高、稳定性好的耐热TA（PtTA）。随后，研究人员为了评估其在实际应用中的潜力，分别以PPO和D,L-PPT为起始底物开发了2个级联体系（图1）。通过采用PtTA驱动的级联体系，实现了高底物浓度下L-PPT的生物合成，其反应具有优异的催化性能，克服了热力学限制，在L-PPT生物合成中具有广阔的应用前景。

图2  PtTA与关键活性中心残基的同源建模

       在该研究中，研究者发现了一种具有良好活性、稳定性和底物耐受性的新型耐热转氨酶PtTA。确定了PtTA的关键活性中心残基。在此基础上，开发了2个PTTA驱动的多酶级联系统，探索了其在L-PPT生产中的应用。利用PPO不对称合成L-PPT，将PtTA、LsGluDh和EsGDH三酶级联，构建了体内三酶级联重组E. Coli G，实现了400 mM PPO的完全转化。此外，还构建了2个转氨酶的级联反应，利用一锅法对D,L-PPT进行去消旋化，在最高底物浓度下获得了90.43%的产率。这些优良的催化性能表明，转氨酶驱动的级联体系在克服热力学限制有效地合成L-PPT方面表现出了巨大的效率，在L-PPT生物合成中具有广阔的应用前景。